ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΠΟΛΗΣ ΕΝΑΝΤΙ HIV 1

Δράση της πρόπολης έναντι του ιού HIV-1 σε κυτταροκαλλιέργειες CD4+ λεμφοκυττάρων και μικρονευρογλοιακών κυττάρων

Genya Gekker a,b, Shuxian Hua,b, Marla Spivak c, James R. Lokensgard a,b,

Περίληψη

Η επείγουσα ανάγκη για επιπρόσθετους παράγοντες της θεραπείας  από μόλυνση του ιού ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας  τύπου 1 (HIV-1) μας οδήγησε στην αξιολόγηση της αντί-HIV-1 δράσης του φυτικού μελισσοκομικού προϊόντος, πρόπολης, σε CD4 λεμφοκύτταρα και σε  μικρονευρογλοιακές κυτταροκαλλιέργειες. Η πρόπολη απέτρεψε την ιογενή έκφραση σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενη από τον τρόπο (μέγιστη καταστολή της τάξης του 85 και 98% παρατηρήθηκε στα 66,6 g/ml πρόπολης σε CD4+ λεμφοκύτταρα και σε μικρονευρογλοιακές  κυτταροκαλλιέργειες, αντίστοιχα).  Παρομοίως η αντί-HIV-1 δράση της παρατηρήθηκε σε δείγματα πρόπολης από διάφορες γεωγραφικές περιοχές. Ο μηχανισμός της αντιικής δράσης της πρόπολης σε CD4+ λεμφοκύτταρα φαίνεται να συνεπάγεται, εν μέρει, και την αποτροπή εισόδου του ιού.

Ενώ η πρόπολη είχε μια επιπρόσθετη αντι-ιική δράση στην ανάστροφη τρανσκριπτάση αναστολέα της ζιβουδίνης, δεν είχε αξιοσημείωτη ιδιότητα στον αναστολέα της πρωτεάσης indinavir. Τα αποτελέσματα αυτής της in vitro μελέτης υποστηρίζει την ανάγκη για κλινικές δοκιμές της πρόπολης σε ένα ή περισσότερα από τα συστατικά της στη θεραπεία από HIV-1 μόλυνση.

Keywords: Propolis; Honey bees; HIV-1; AIDS

© 2005 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–163

Εισαγωγή

Μια ποικιλία φυτικών προϊόντων ή κάποιων παραγώγων τους, έχουν θεωρηθεί ως πιθανοί υποψήφιοι για τη θεραπεία της μόλυνσης από τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1) (Cowan, 1999· De Clercq, 2000). Δεδομένης της κλιμάκωσης των κρουσμάτων HIV-1, της αντίστασης στη κλασσική θεραπεία αντιρετροϊκών φαρμάκων καθώς και η ανάγκη να είναι λιγότερο τοξικά και ακριβά από εκείνα που χρησιμοποιούνται σήμερα, η αναζήτηση για νέες θεραπείες μεταξύ αυτών και των φυτικών προϊόντων είναι δικαιολογημένη. Στην παρούσα μελέτη, ένα τέτοιο προϊόν και πιο συγκεκριμένα η πρόπολη, αξιολογήθηκε in vitro για την έκφραση των ιδιοτήτων της  έναντι του ιού HIV-1.

Η πρόπολη (αναφέρεται επίσης ως ” κόλλα της μέλισσας “) είναι μια ισχυρή κολλώδης και ρητινώδης ουσία . η οποία συλλέγεται από τις μέλισσες , από δέντρα και φύλλα. Ενώ η πρόπολη παράγεται από μια ποικιλία φυτών, τα περισσότερα φυτικά είδη δεν είναι γνωστά γιατί η  προπολο – συλλογή πραγματοποιείται ψηλά σε δέντρα έτσι, είναι δύσκολο να παρατηρηθεί. Μόνο ένα είδος φυτού το, Baccharis dracunculifolia, έχει καθιερωθεί ως μια πηγή πρόπολις (Santos et al. , 2003), αν και τα διάφορα γένη, όπως δηλαδή τα Populus, Clusia και Araucaria, θεωρούνται ως πρόσθετες πηγές πρόπολης (Bankova et al. , 2000).  Ονομάζονταν έτσι από τους Έλληνες (σύμφωνα με κάποιους μελετητές του Αριστοτέλη), “προ” (προ των πυλών, για την άμυνα) και “πόλη” (η πόλη), η πρόπολη χρησιμοποιείται για να προστατεύει την είσοδο της κυψέλης από εισβολείς και εντός της κυψέλης συμβάλλει στη προστασία εναντίον ενός ευρέος φάσματος μικροοργανισμών (Banskota et al. , 2001· Burdock, 1998).

Χρησιμοποιείται ως φάρμακο από αρχαιοτάτων χρόνων, η πρόπολη έχει πρόσφατα αποδειχθεί να διαθέτει και ένα ευρύ φάσμα αντιμικροβιακής δράσης, συμπεριλαμβανομένης  και της δράσης της εναντίον πολλών παθογόνων παραγόντων που σχετίζονται με τον ιό ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (AIDS) (Banskota et al. , 2001·Burdock, 1998).  Μελέτες της αντιμικροβιακής της δράσης έχουν επικεντρωθεί κυρίως για τον ιό του  έρπητα (Herpes simplex virus) (Amoros et al. ,1994· Vynograd et al. , 2000) και τον ιό της γρίππης (influenza virus) (Serkedjieva et al., 1992).

Χρησιμοποιώντας μια σειρά κυττάρων (CEMcells), Harish et al. (1997) έδειξε ότι η πρόπολη εμπόδισε την έκφραση του HIV-1. Ωστόσο, λίγα ή καθόλου δεδομένα έχουν δημοσιευθεί, σχετικά με την αντιρετροική της δράση στα πρωτογενή κύτταρα του HIV-1, δηλαδή των CD4 λεμφοκυττάρων και μακροφάγων, που ήταν και το αντικείμενο της παρούσας μελέτης.

Συντομογραφίες:

Ag, αντιγόνο ; AIDS,  σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας; HIV-1, ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 ; MTT, 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; CPRG, 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-_-d-galactoside∗ αντίστοιχη συγγραφέας. Παρούσα διεύθυνση: Τμήμα Ιατρικής, Hennepin  Νομαρχιακού Ιατρικού κέντρου, 701 Park Avenue, Minneapolis, MN 55415, USA. Τηλ. : 1 612 873 2877· fax: 1 612 904 4299.E-mail : peter137@umn.edu (P. K. Peterson).

1. Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–163

Υλικά και μέθοδοι

2.1 . Δείγματα Πρόπολης

Ακατέργαστη πρόπολη αγοράστηκε από την εταιρεία Cannon Honey Bee (Minneapolis, MN) και χρησιμοποιήθηκε για τα περισσότερα πειράματα. Για να προσδιοριστεί κατά πόσον η αντίιική δράση της πρόπολης που συλλέχθηκε από την Cannon Honey Bee ήταν αντιπροσωπευτική με αυτή της δράσης από πρόπολη που συλλέγεται και από άλλες γεωγραφικές τοποθεσίες, δείγματα ακατέργαστης πρόπολης συλλέχθηκαν και από αποικίες που βρίσκονταν νοτιοανατολικά (παρέχεται από BeeHive Botanicals Hayward, WI) , βόρεια, Minnesota (παρέχεται από  B&B Honey Farm, Houston, MN), από τρεις πολιτείες στη Βραζιλία  (Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro and Minais Gerais; (Παρέχεται από Apis Flora στο Ribeir˜ao Preto SP) και από τη Κίνα ( παρέχεται από BeeHive Botanicals).  Όλα τα παραπάνω δείγματα πρόπολης είχαν συλλεχθεί από τρίψιμο των ξύλων της κυψέλης και από άγνωστο αριθμό αποικιών μελισσών. Για να προσδιοριστεί εάν υπήρχε διακύμανση μεταξύ των αποικιών που βρίσκονταν σε συγκεκριμένες γεωγραφικές περιοχές και για να αποκτήσουν καθαρά δείγματα πρόπολης (αμόλυντα από κερί και υπολείμματα ξύλου ), τοποθετηθήκαν και προπολο παγίδες (J&D Manufacturing, MI)  από τρεις αποικίες σε κάθε μία από τις τρεις θέσεις στη Μινεσότα: (Πανεπιστήμιο της Μινεσότα, St. Paul campus, Χιούστον, νοτιοανατολική MN) και στο Duluth (βόρεια MN).

2.2 . Αιθανολικό εκχύλισμα πρόπολης

Εκχύλισμα αιθανόλης πρόπολης είχε προετοιμαστεί όπως περιγράφεται προηγουμένως (Kress, 1996).  Εν συντομία, η πρόπολη τρίφτηκε και 20% αιθανολικό εκχύλισμα της πρόπολης προετοιμάστηκε (20 g πρόπολη ολοκληρώνοντας τον όγκο των 100 ml από 95% αιθυλική αλκοόλη), προστατευμένο από το φως, με μέτρια ανακίνηση σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από 1 εβδομάδα, τα εκχυλίσματα φιλτραρίστηκαν και αραιώθηκαν σε θρεπτικό μέσο για την διεκπεραίωση των πειραμάτων.

2.3 .  Απομόνωση HIV-1

HIV-1AT απομόνωση με χαρακτηριστικά ενός T-tropic (X4) στελέχους και HIV-1SF162, monocytotropic (R5)  παραλλαγή που παράχθηκε από το ΝΙΗ AIDS Research and Reference Reagent Program (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, MD), χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη.

2.4 . Κυτταροκαλλιέργειες και μέθοδοι κυτταροτοξικότητας

Περιφερικά αιμοποιητικά μονοπύρηνα κύτταρα ελήφθησαν από φλεβικό αίμα υγιών δοτών και χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι, που περιγράφηκαν προηγουμένως (Gekker et al. , 2001) για να προετοιμάσουν και να απομονώσουν ενεργά CD4 λεμφοκύτταρα (≥98% των κυττάρων χρωματίστηκαν θετικά με αντι-CD4 αντισώματα).  Μικρονευρογλοιακά κύτταρα (οι μακροφάγοι κάτοικοι του εγκεφάλου) απομονώθηκαν από ανθρώπινους εμβρυικούς ιστούς

1. Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–163

εγκεφάλου, σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Institutional Review Board και ομοιογενής καλλιέργεια κυττάρων (≥99% χρωματίστηκαν θετικά με αντι-CD68 αντισώματα) παρασκευάστηκε όπως περιγράφθηκε παραπάνω (Peterson et al. , 1999). Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξική δράση της πρόπολης, η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε μικροσκοπικά χρησιμοποιώντας μια μέθοδο αποκλεισμού trypan blue, επίσης αξιολογήθηκε  με χρήση μίας MTT μεθόδου προσδιορισμού. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, mitochondrial dehydrogenase, όπως περιγράφεται παραπάνω

(Jiang et al., 2001).

Σχ. 1. Δράση της πρόπολης στην έκφραση του ιού HIV-1 σε CD4 λεμφοκύτταρα και σε μικρονευρογλοιακές κυτταροκαλλιέργειες . Ενεργοποιημένα CD4+ λεμφοκύτταρα είχαν επιμολυνθεί με HIV-1AT (A) και μικρονευρογλοιακά κύτταρα είχαν επίσης επιμολυνθεί με  HIV-1SF162 ” (Β) στην απουσία (control – ορός ποιοτικού ελέγχου) ή την παρουσία  πρόπολης (Cannon Honey Bee Company προετοιμασία) σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις. Τα στοιχεία αυτά είναι ± S.D εις τριπλούν και είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που χρησιμοποιήθηκαν CD4+ λεμφοκύτταρα από διαφορετικούς δότες και μικρονευρογλοιακά  που απομονώθηκαν από διαφορετικά δείγματα εγκεφαλικού ιστού.

Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–163

Χρησιμοποιώντας την MTT μέθοδο προσδιορισμού , η επιλεκτικότητα δείκτη καθορίστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω (Amres et al. , 2001), δηλαδή η σχέση του 50% κυτταροτοξικής συγκέντρωσης (CC50) στο 50% αποτελεσματικής συγκέντρωσης (EC50).

2.5.  Αξιολόγηση της αντί-HIV-1 δράσης

Για να αξιολογηθεί η δράση της πρόπολης στην έκφραση του HIV-1, συγκεκριμένες συγκεντρώσεις πρόπολης προστέθηκαν για την ενεργοποίηση είτε των CD4+ λεμφοκυττάρων σε κυτταροκαλλιέργειες  τη στιγμή της μόλυνσης με τον HIV-1AT  ή σε καλλιέργειες μικρονευρογλοιακών κυττάρων

με τον HIV-1SF162. Μετά από 2 (CD4+ κύτταρα) ή 18ώρες (μικρονευρογλοιακά) επώασης αντίστοιχα, τα κύτταρα πλύθηκαν και αιωρήθηκαν είτε σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας μόνα τους (ορός ποιοτικού ελέγχου – control) ή σε μέσο που περιείχε πρόπολη. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ημέρες ( τα CD4+ κύτταρα) ή για 7 ημέρες (τα μικρονευρογλοιακά ) και τα αντίστοιχα υπερκείμενα συγκεντρώθηκαν για μέτρηση των p24 Ag επιπέδων. Σε κάποιο πείραμα, πρόπολη προστέθηκε σε κυτταροκαλλιέργειες που ταυτόχρονα αντιμετωπίζονταν με zidovudine (AZT) ή indinavir σε συγκεντρώσεις φαρμάκων που προσέγγιζαν τις τιμές EC50 και μετά από πλύσιμο , κύτταρα εναιωρούνταν σε μέσο θρεπτικό υλικό (control) μόνα τους ή σε θρεπτικό μέσο που περιείχε πρόπολη με AZT ή indinavir. Η HIV-1 έκφραση των CD4+ λεμφοκυττάρων και μικρονευρογλοιακών κυτταροκαλλιεργειών προσδιορίστηκε μετρώντας  τα επίπεδα του p24 αντιγόνου (Ag) σε κυτταροκαλλιέργειες, τα υπερκείμενα υγρά μετρήθηκαν με ELISA, όπως περιγράφηκε παραπάνω (Gekker etal., 2001; Peterson et al., 1999).

1. Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–16

Εικ.2. Δράση της πρόπολης έναντι του HIV-1 από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές (Α)

εμπορικές πηγές στη Μινεσότα : εταιρεία Cannon Bee Honey, Νοτιοανατολικά ή

βόρεια της Μινεσότα ; (Β) τρεις (3) αποικίες σε τρείς (3) συγκεκριμένες περιοχές στη Μινεσότα: Χιούστον (νοτιοανατολικά), Πανεπιστήμιο Μινεσότα, Πανεπιστημιούπολη Άγιος Παύλος και Ντούλουθ (βόρεια) ;  (C) τρείς (3) πολιτείες στη Βραζιλία και τη Κίνα. Ενεργοποιημένα CD4+ λεμφοκύτταρα επιμολύνθηκαν με HIV-1 εν απουσία ορού ποιοτικού ελέγχου (control) ή παρουσία πρόπολης σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις. Τα στοιχεία είναι ±S.D τριπλών δειγμάτων δύο (2) ανεξάρτητων πειραμάτων χρησιμοποιώντας CD4+ κυττάρων από διαφορετικούς δότες.

1. Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–163

2.6. Αξιολόγηση της ιικής εισόδου

Για να καθοριστούν οι ιδιότητες της  πρόπολης  στον HIV-1 σε CD4+  λεμφοκύτταρα , χρησιμοποιήσαμε τον ιό της δαμαλίτιδας (ευλογιά) βασισμένο σε ποσοτική μέθοδο κυτταρικής συγκέντρωσης – βασισμένη σε ενεργοποίηση του γονιδίου αναφοράς σε απόκριση στην HIV-1 IIIB-Env γλυκοπρωτείνη- μεσολαβούμενη σύντηξη μεμβρανών (Nussbaum et al., 1994; Stantchev and

Broder, 2000) με μικρές τροποποιήσεις (Lokensgard et al., 2002). Ο ενεργοποιημένος ιός της δαμαλίτιδας σε CD4+  λεμφοκύτταρα αντιμετωπίστηκε με πρόπολη πριν την ανάμειξη με τα επιμολυσμένα HeLa S3 κύτταρα με τον ιό της δαμαλίτιδας και το ποσοστό της γαλακτοσιδάσης στις καλλιέργειες προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το CPRG υπόστρωμα. Οι συγκεντρώσεις της γαλακτοσιδάσης στο κυτταρόλυμα προσδιορίστηκαν από μια τυπική καμπύλη.

2.7 . Στατιστική ανάλυση

Για τη σύγκριση των μέσων πολλαπλών ομάδων, ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) πραγματοποιήθηκε ακολουθούμενη από Sheffe’s F τεστ. Για την ανάλυση των ιδιοτήτων της πρόπολης στην ιογενή είσοδο, στην οποία οι τιμές της πρόπολης από τα εξεταζόμενα δείγματα εκφράστηκαν σε επί της  % αναστολή σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα (ορός ποιοτικού ελέγχου – control ) δείγματα, χρησιμοποιήθηκε ένα πολλαπλών ιδιοτήτων επαναλαμβανόμενο μοντέλο μέτρησης που υπολογίζει κατά μέσο όρο συσχετισμούς και  εγγενείς διαφορές μεταξύ των ατόμων. Η μέθοδος Tukey εφαρμόστηκε για να ρυθμίσει πολλαπλές συγκρίσεις και η μικτή διαδικασία στην SAS έκδοση 8.2 χρησιμοποιήθηκε για να πραγματοποιηθεί αυτή η ανάλυση.

Αποτελέσματα και συζήτηση

Πριν την έρευνα για τις ιδιότητες της έκφρασης έναντι του  HIV-1, πραγματοποιήθηκε ένα πείραμα για να προσδιοριστεί κατά πόσο η πρόπολη (Cannon Honey Bee Company) ήταν τοξική για τα CD4+  λεμφοκύτταρα ή για τα μικρογλοιακά κύτταρα. Μετά από 4 ημέρες επώασης από την απουσία (control) ή παρουσία πρόπολης (σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονταν μεταξύ 0,82 και 200 μg /ml), η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε ποσοτικά με trypan blue χρωστική αποκλεισμού και MTT ποσοτικό προσδιορισμό. Σε συγκεντρώσεις πρόπολης ≤ 66.6μg/ml, η βιωσιμότητα των επεξεργασμένων κυττάρων και από τις δύο δοκιμασίες δεν διέφεραν από τα κύτταρα ελέγχου. Έτσι, για όλα τα πειράματα, εκχύλισμα πρόπολης χρησιμοποιήθηκε σε συγκεντρώσεις των 66,6 μg/ml ή λιγότερο. Για να προσδιοριστεί η ιδιότητα της πρόπολης στην έκφραση του HIV-1, τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις πρόπολης που ελήφθησαν από την Cannon Honey Bee Company. Όπως φαίνεται στην Εικ.1 , η πρόπολη ανέστειλε σε μία συγκέντρωση-εξαρτώμενου τρόπου την έκφραση του HIV-1 σε CD4+ λεμφοκύτταρα και σε μικρογλοιακές κυτταροκαλλιέργειες. Στις CD4+ κυτταροκαλλιέργειες, 66.6μg/ml πρόπολης ανέστειλε  >85%  την έκφραση του X4 HIV-1 παραλλαγή (Εικ.1Α) και στις μικρογλοιακές κυτταροκαλλιέργειες, 66.6μg/ml πρόπολης ανέστειλε την έκφραση του ιού R5 HIV-1SF162 απομονώθηκε κατά 98% (Εικ. 1B). Ο δείκτης επιλεκτικότητας (CC50/EC50) ήταν 6.7 για τα CD4+ λεμφοκύτταρα και 16.3 για τα μικρογλοιακά κύτταρα. Για να καθοριστεί εάν η αντιμικροβιακή δράση της πρόπολης διέφερε σε δείγματα διαφορετικών περιοχών

1. Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–163

της Μινεσότα, παρασκευάσματα νοτιοανατολικά και βόρεια της Μινεσότα συγκρίθηκαν με αυτά της εταιρείας Cannon Honey Bee σε καλλιέργειες  CD4+ λεμφοκυττάρων. Όπως φαίνεται στην Εικ.2^Α η δράση αυτών των προπολών έναντι του HIV-1 ήταν παρόμοια. Επιπλέον, συλλέχθηκε πρόπολη από τρεις ξεχωριστές αποικίες σε τρεις περιοχές της πολιτείας (Houston, St. Paul and Duluth, MN) όπου αξιολογήθηκε να έχει συγκρίσιμη αντιική δράση (Εικ.2Β).  Δείγματα πρόπολης αξιολογήθηκαν για τη δράση τους στον ιό HIV-1 και από τρείς πολιτείες της Βραζιλίας και από την Κίνα αλλά δείγμα από το Rio de Janeiro εμφανίστηκε λιγότερο αποτελεσματικό (<50% ανέστειλε την έκφραση του ιού στα   66.6 μg/ml πρόπολης) (Εικ.2Γ) .

Λόγω της αντοχής του HIV-1 να αντιστρέφει τον αναστολέα της μεταγραφάσης (RTI) s και τον αναστολέα της πρωτεάσης (PI) s, η αντι-ιική έρευνα έχει κατευθυνθεί τα τελευταία χρόνια στην εύρεση φαρμάκων που λειτουργούν μέσω διαφορετικών μηχανισμών, όπως παρεμβαίνοντας στα κύτταρα με την είσοδο του HIV-1. Χρησιμοποιώντας μία μέθοδο κυτταρικής σύντηξης, η οποία μετράει την είσοδο των  HIV-1 κυττάρων στα CD4+ λεμφοκύτταρα, η  πρόπολη (Cannon Honey Bee Company) κατέστειλε τη σύντηξη κυττάρων σε όλες τις συγκεντρώσεις όπου ελέγχθηκε με έναν  EC50 περίπου στα 22.2μg/ml (Εικ.3). Χρησιμοποιώντας CD4+ λεμφοκύτταρα από τρείς διαφορετικούς δότες,  22.2 μg/ml πρόπολης κατέστειλαν τη κυτταρική σύντηξη  κατά 52.3±4.9% (mean±S.E.). Επομένως, αποδείχθηκε ότι η αντι-ική δράση σε CD4+ λεμφοκύτταρα παρεμβαίνει, τουλάχιστον εν μέρει,  αναστέλλοντας την είσοδο του ιού στα κύτταρα. Στις μέρες μας, συνδυασμοί αντιρετροικών θεραπειών χρησιμοποιούνται με διαφορετικούς μηχανισμούς  δράσης. Για τη μελέτη πιθανών αλληλεπιδράσεων  μεταξύ της πρόπολης και τυπικών αντιρετροϊκών παραγόντων, πρόπολη (Cannon Honey Bee Company) προστέθηκε σε καλλιέργειες CD4+ λεμφοκύτταρων και μικρονευρογλοιακών κυττάρων όπου ταυτόχρονα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AZT ή indinavir. Όπως φαίνεται στην Εικ. 4, σε συγκέντρωση 7.4 μg/ml, η πρόπολη φάνηκε να έχει μία επιπρόσθετη δράση μεσολάβησης στην ιογενή καταστολή (Εικ.4) , όμως δεν είχε καμία δράση στην ινδιναβίρη (Εικ.4) στις καλλιέργειες των CD4+ λεμφοκυττάρων. Όταν μελετήθηκαν τα μικρονευρογλοιακά κύτταρα, η πρόπολη και πάλι είχε μία επιπρόσθετη ιδιότητα στο AZT (Εικ. 5) και καμία αξιοσημείωτη δράση στην ινδιναβίρη (Εικ. 5).

Εικ. 3. Δράση της πρόπολης στην ιογενή είσοδο. CD4+ λεμφοκύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σε συνεργασία με IIIB-Env εκφράζοντας τα HeLa S3 κύτταρα στην απουσία (ορός ποιοτικού ελέγχου- control) ή παρουσία πρόπολης και η σύντηξη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ενεργοποίησης του γονιδίου ανταποκριτή και αναλύθηκε με τη χρωματομετρική μέθοδο CPRG. Τα στοιχεία (mean±S.E.M. των τιμών από τρείς διαφορετικούς δότες) εκφράζονται ως ποσοστιαία αναστολή της γαλακτοσιδάσης ως προς τις τιμές αναφοράς. **P < 0.01 vs. Control  (από μικτό μοντέλο ανάλυσης που ενσωματώνει διόρθωση εντός ατόμου).

Εικ. 4. Δράση της πρόπολης στα αντιρετροικά φάρμακα σε επιμολυσμέναCD4+ λεμφοκύτταρα με HIV-1AT στην απουσία (ορός ποιοτικού ελέγχου- control) ή παρουσία πρόπολης μόνης ή σε συνδυασμό με: (A) AZT or (B) indinavir. Τα στοιχεία (mean±S.D) των τιμών είναι εις τριπλούν και αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα όπου χρησιμοποιήθηκαν CD4+ λεμφοκύτταρα από διαφορετικούς δότες. **P < 0.01, συγκρίθηκαν με AZT στην απουσία πρόπολης από την (ANOVA).

Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–163

Εικ. 5. Δράση της πρόπολης στα αντιρετροικά φάρμακα σε μικρονευρογλοιακές κυτταροκαλλιέργειες. Τα μικρονευρογλοιακά κύτταρα επιμολύνθηκαν με  HIV-1SF162 στην απουσία (ορός ποιοτικού ελέγχου- control) ή παρουσία πρόπολης μόνης ή σε συνδυασμό με: (A) AZT or (B) indinavir. Τα στοιχεία (mean±S.D) των τιμών είναι εις τριπλούν και αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα χρησιμοποιώντας μικρονευρογλοιακά κύτταρα από διαφορετικά δείγματα εγκεφαλικών ιστών **P < 0.01, με AZT στην απουσία πρόπολης από την (ANOVA).

4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτών των in vitro μελετών δείχνουν ότι η πρόπολη έχει ισχυρές αντιικές ιδιότητες έναντι του Χ4 και Χ5 HIV-1 παραλλαγές στους κύριους τύπους κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί από αυτόν τον ιό in vivo.Η μελέτη μας με τα CD4+ λεμφοκύτταρα συμπεραίνει ότι η πρόπολη από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές έχει παρόμοια δράση και ότι η πρόπολη λειτουργεί τουλάχιστον εν μέρει , ως αναστολέας της ιικής εισόδου. Επίσης, τα αποτελέσματα μας δηλώνουν ότι είναι απίθανο η πρόπολη να ανταγωνίζεται την αντι-ιική HIV-1 δράση των RTIs όπως του AZT ή του PIs ή όπως η ινδιναβίρη. Το αντιρετροϊκό συστατικό ή συστατικά της πρόπολης , του φυτικού αυτού προϊόντος το οποίο περιέχει πάνω από 180 συστατικά (Burdock, 1998), δεν είναι γνωστό. Παρ όλα αυτά, τα φλαβονοειδή (Wang et al., 1998; Critchfield et al., 1996; Xu et al., 2000), παράγωγα του μορονικού οξέως (Ito et al., 2001), και καφεϊκού οξέως (Burke et al., 1995), όλα από τα οποία περιέχονται στη πρόπολη έχουν αποδειχθεί από διάφορες ερευνητικές ομάδες να έχουν αντι-HIV-1 δράση. Η ευρεία χρήση της πρόπολης ως  φυτικού φαρμάκου  για σχεδόν τρεις χιλιετίες και τα αποτελέσματα από τις τοξικολογικές μελέτες σε τρωκτικά (Burdock, 1998), δηλώνουν ότι η πρόπολη είναι σχετικά ασφαλής.

Παρ ‘όλα αυτά, η απουσία εκθέσεων-αναφορών είτε σχετικά με την αποτελεσματικότητα της πρόπολης είτε με την ασφάλεια της στη θεραπεία λοίμωξης από HIV-1 σε συνδυασμό με τις πρόσφατες ενδείξεις δυσμενών αλληλεπιδράσεων με άλλα φυτικά προϊόντα για την βιοδιαθεσιμότητα της PIs (Piscitelli et al., 2000, 2002) δηλώνει ότι πριν η πρόπολη θεωρηθεί κατάλληλη και ασφαλής για κλινική χρήση πρέπει να διεξαχθούν φαρμακοκινητικές μελέτες και σε HIV-1 οροθετικούς ασθενείς που λαμβάνουν συγκεκριμένους αντιρετροικούς παράγοντες.

Gekker et al. / Journal of Ethnopharmacology 102 (2005) 158–163

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Ινστιτούτο Εγκεφάλου και , Ανοσολογικών διαταραχών Minneapolis Medical Research Foundation, Minneapolis, MN. Είμαστε ευγνώμονες για την πολύτιμη βοήθεια του Dr. Fred Kravitz και του Shannon Benson για τη βοήθεια τους στην προετοιμασία του χειρογράφου.

References

Amoros, M., Lurton, E., Boustie, J., Girre, L., Sauvager, F., Cormier,

M., 1994. Comparison of the anti-herpes simplex virus activities of

propolis and 3-methyl-but-2-enyl caffeate. Journal of Natural Products

57, 644–647.

Amres, K., Bucar, F., Kartnig, T., Witvrouw, M., Pannecouque, C., De

Clercq, E., 2001. Antiviral activity against human immunodeficiency

virus type 1 (HIV-1) and type 2 (HIV-2) of ethnobatanicaly selected

Ethiopian medicinal Plants. Phytotherapy Research 15, 62–69.

Bankova, V.S., De Castro, S.L., Marcucci, M.C., 2000. Propolis recent

advances in chemistry and plant origin. Apidologie 31, 3–15.

Banskota, A.H., Tezuka, Y., Kadota, S., 2001. Recent progress in pharmacological

research of propolis. Phytotherapy Research 15, 561–571.

Burdock, G.A., 1998. Review of the biological properties and toxicity of

bee propolis (propolis). Food and Chemical Toxicology 36, 347–363.

Burke Jr., T.R., Fesen, M.R., Mazumder, A., Wang, J., Carothers, A.M.,

Grunberger, D., Driscoll, J., Kohn, K., Pommier, Y., 1995. Hydroxylated

aromatic inhibitors of HIV-1 integrase. Journal of Medicinal

Chemistry 38, 417–4178.

Cowan, M.M., 1999. Plant products as antimicrobial agents. Clinical

Microbiology Reviews 12, 564–582.

Critchfield, J.W., Butera, S.T., Folks, T.M., 1996. Inhibition of HIV activation

in latently infected cells by flavonoid compounds. AIDS Research

and Human Retroviruses 12, 39–46.

De Clercq, E., 2000. Current lead natural products for the chemotherapy

of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Medicine Research

Reviews 20, 323–349.

Gekker, G., Lokensgard, J.R., Peterson, P.K., 2001. Naltrexone potentiates

anti-HIV-1 activity of antiretroviral drugs in CD4+ lymphocyte

cultures. Drug and Alcohol Dependence 64, 257–263.

Harish, Z., Rubinstein, A., Golodner, M., Elmaliah, M., Mizrachi,

Y., 1997. Suppression of HIV-1 replication by propolis and its

immunoregulatory effect. Drugs and Experimental Clinical Research

23, 89–96.

Ito, J., Chang, F.R., Wang, H.K., Park, Y.K., Ikegaki, M., Kilgore, N., Lee,

K.H., 2001. Anti-AIDS agents: 48 (1) anti-HIV activity of moronic

acid derivatives and the new melliferone-related triterpenoid isolated

from Brazilian propolis. Journal of Natural Products 64, 1278–1281

Jiang, Z.-G., Piggee, C., Heyes, M.P., Murphy, C., Quearry, B., Bauer,

M., Zheng, J., Gendelman, H.E., Markey, S.P., 2001. Glutamate is

a mediator of neurotoxicity in secretions of activated HIV-1 infected

macrophages. Journal of Neuroimmunology 117, 97–107.

Kress, R., 1996. Value-Added Products from Beekeeping. FAO Agricultural

Services Bulletin. Rome, Italy.

Lokensgard, J.R., Gekker, G., Peterson, P.K., 2002. Kappa-opioid receptor

agonist inhibition of HIV-1 envelope glycoprotein-mediated membrane

fusion and CXCR4 expression on CD4 (+) lymphocytes. Biochemical

Pharmacology 63, 1037–1041.

Nussbaum, O., Broder, C.C., Berger, E.A., 1994. Fusogenic mechanisms

of enveloped-virus glycoproteins analyzed by a novel recombinant

vaccinia virus-based assay quantitating cell fusion-dependent reporter

gene activation. Journal of Virology 68, 5411–5422.

Peterson, P.K., Gekker, G., Hu, S., Lokensgard, J., Portoghese, P.S., Chao,

C.C., 1999. Endomorphin-1 potentiates HIV-1 expression in human

brain cell cultures: implication of an atypical mu-opioid receptor. Neuropharmacology

38, 273–278.

Piscitelli, S.C., Burstein, A.H., Chaitt, D., Alfaro, R.M., Falloon, J., 2000.

Indinavir concentrations and St. John’s wort. Lancet 355, 547–548.

Piscitelli, S.C., Burstein, A.H., Welden, N., Gallicano, K.D., Falloon, J.,

2002. The effect of garlic supplements on the pharmacokinetics of

saquinavir. Clinical Infectious Diseases 34, 234–238.

Santos, F.A., Bastos, E.M.A.F., Maia, A.B.R.A., Uzeda, M., Carvalho,

M.A.R., Farias, L.M., Morreira, E.S.A., 2003. Brazilian propolis:

physicochemical properties, plant origin and antibacterial activity of

perodontopathogenes. Phytotherapy Research 17, 285–289.

Serkedjieva, J., Manolova, N., Bankova, V., 1992. Anti-influenza virus

effect of some propolis constituents and their analogues (esters of

substituted cinnamic acids). Journal of Natural Products 55, 294–302.

Stantchev, T.S., Broder, C.C., 2000. Consistent and significant inhibition

of human immunodeficiency virus type 1 envelope-mediated

membrane fusion by beta-chemokines (RANTES) in primary human

macrophages. Journal of Infectious Diseases 182, 68–78.

Vynograd, N., Vynograd, I., Sosnowski, Z., 2000. A comparative multicentre

study of the efficacy of propolis, acyclovir and placebo in the

treatment of genital herpes (HSV). Phytomedicine 7, 1–6.

Wang, H.K., Xia, Y., Yang, Z.Y., Natschke, S.L., Lee, K.H., 1998. Recent

advances in the discovery and development of flavonoids and their

analogues as antitumor and anti-HIV agents. Advances in Experimental

Medicine and Biology 439, 191–225.

Xu, H.X., Wan, M., Dong, H., But, P.P., Foo, L.Y., 2000. Inhibitory

activity of flavonoids and tannins against HIV-1 protease. Biological

Pharmacology Bulletin 23, 1072–1076.[/vc_column_text][/vc_column][/vc_row][/vc_section]